Laporan Pembuatan Stock Dan Penanaman Eksplan

Laporan Pembuatan Stock Dan Penanaman Eksplan

I.              PENDAHULUAN

1.1   Latar Belakang

Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada proses penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow).

Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba.

Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.

Berdasarkan penjelasan di atas maka sangat penting bagi kita untuk melaksanakan praktikum ini agar menambah pengetahuan kita tentang pengembangan tanaman melalui proses kultur jaringan.

1.2  Tujuan dan Kegunaan

Tujuan praktikum penanaman kultur dan pembuatan larutan stock sebagai bahan media yaitu:

1. Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur.
2. Mengamati pertumbuhan eksplan
3. Mencari factor-faktor penyebab kontaminasi dalam kultur jaringan tanaman.

Kegunaan praktikum ini untuk menambah pengetahuan kita dalam mengembangkan tanaman melalui proses kultur jaringan.

II.  TINJAUAN PUSTAKA

Dalam media kultur berisi hara makro dan mikro yang dibutuhkan untuik pertumbuhan tanaman, demikian pula sumber karbohidrat, vitamin, agar dan ZPT atau ekstrak tanaman yang diperlukan. Media kultur yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS), yang pada awalnya dikembangkan untuk kultur tembakau tetapi ternyata cocok untuk berbagai jenis tanaman. Beberapa prosedur yang penting dalam pembuatan media adalah pembuatan larutan stok dan sterilisasi media (Rahardja, 1995)

Penggunaan larutan stok dalam pembuatan media akan mengurangi jumlah perkejaan yang sifatnya berulang-ulang, sehingga kesalahan manusia atau percobaan (human atau experimental error) dapat dikurangi. Selain itu, penimbangan secara langsung dari bahan-bahan pembuat media, seperti hara mikro dan ZPT, yang membutuhkan dalam jumlah yang sangat sedikit (miligram atau mikrogram) pada formulasi akhir tidak akan diperoleh secara akurat. Oleh karena itu sudah menjadi prosedur baku untuk komponen-komponen tersebut dibuat dalam larutan stok (Sriyanti, 2002).

Untuk membuat larutan stok, senyawa-senyawa yang dibutuhkan ditimbang dan diletakkan pada gelas ukur bersih. Kepekatan larutan stok umumnya dibuat antara 10-1000 kali, tergantung pada daya larut dari senyawa-senyawa yang akan dilarutkan. Sebelum ditambahkan dengan air destilasi, beberapa bahan kimia ada yang harus dilarutkan dahulu dengan pelarut etil alkohol, 1 N NaOH atau 1 N HCl dalam jumlah yang kecil atau beberapa tetes. Selanjutnya air detilasi ditambahkan secara perlahan sampai volume yang diinginkan. Jangan lupa pada wadah/botol larutan diberi label berisi nama  

larutan, tanggal pembuatan dan kadaluarsa, dan nama orang yang membuatnya. Untuk beberapa bahan tertentu, misalnya IAA, stok larutannya harus disimpan dalam botol gelap untuk mencegah dekomposisi oleh cahaya (Anonim, 2009).

2.1  Hara Makro

Larutan stok hara makro dapat dibuat 10 atau 20 kali dari konsentrasi akhir. Larutan stok untuk garam kalsium disarankan untuk dipisahkan untuk mencegah adanya pengendapan. Larutan stok hara makro dapat disimpan dengan aman untuk beberapa minggu dalam keadaan gelap di tempat yang sejuk. Penyimpanan dalam refrigerator pada suhu 2o-4oC merupakan kondisi yang terbaik. Disarankan pula semua larutan stok hara makro untuk disaring terlebih dahulu sebelum disimpan untuk menghindari partikel-partikel yang tidak larut (Anonim, 2010).

2.2   Hara Mikro

Larutan stok hara mikro umumnya dibuat 100 kali dari konsentrasi akhir. Penyimpanan larutan stok hara mikro disarankan disimpan dalam refrigerator atau freezer. Mellor dan Stace-Smith menyatakan bahwa larutan stok mikro dapat disimpan selama lebih dari 1 tahun dalam refrigerator. Gamborg dan Shyluk menyarankan untuk stok KI sebaiknya dibuat konsentrasi 100 x dan disimpan secara terpisah dengan stok mikro lainnya. Begitu pula untuk larutan stok besi (Fe) dibuat dan disimpan ditempat yang terpisah dalam botol yang berwarna gelap (Anonim, 2010).

2.3  Vitamin

Larutan stok vitamin dibuat dengan konsentrasi 100 x atau 1000 x dan disimpan dalam freezer (-20oC). Apabila refrigerator atau freezer tidak tersedia, larutan vitamin harus dibuat setiap media akan dibuat. Larutan stok vitamin dalam refrigerator dapat disimpan selama 2-3 bulan, setelah waktu tersebut lartuan harus diganti yang baru (Rahardja, 1995).

2.4  Zat Pengatur Tumbuh

NAA dan 2,4-D termasuk ZPT yang tergolong stabil dan dapat disimpan dalam suhu 4oC selama beberapa bulan, sedangkan larutan IAA harus disimpan dalam freezer pada suhu -20oC. Penyimpanan larutan IAA pada suhu 4oC dalam botol berwarna gelap dapat bertahan tidak lebih dari satu minggu. Larutan stok auksin umumnya dibuat dalam konsentrasi 100 x atau 1000 x. Untuk membuat larutan IAA dan 2,4-D, terlebih dahulu harus dilarutkan dalam alkohol 95% beberpa tetes, kemudian ditambahkan air double destilasi sampai volume yang diinginkan. Sedangkan NaOH 1 N digunakan untuk melarutkan NAA, juga dapat untuk melarutkan IAA dan 2,4-D. Apabila menggunakan pelarut HCl atau NaOH, pH larutan harus diatur 5.5-5.8 (Anonim, 2010).

Problem terbesar yang dihadapi para tissue culturist adalah kontaminasi mikroba pada kultur (baik bakteri maupun jamur). Dua cara dapat dilakukan untuk mengurangi kontaminasi kultur, yaitu (Anonimous, 2009).

Untuk meningkatkan kesuksesan menggunakan chlorine, langkah berikut semestinya diikutsertakan: Tambahkan deterjen ke larutan kloringe, misalnya beberapa tetes Tween 20 atau Triton. Berikan sedikit tekanan pada perlakuan chlorine. Ini dapat dilakukan dengan desikator vakum yang disambungkan ke air atau pompa tipe lain. Goyang – goyangkan (agitasi) larutan klorine secara manual atau dengan menggunakan shaker selama periode disinfestasi (Gunawan, 1988).

Semua teknik tersebut akan meningkatkan kontak tanaman dengan larutan klorine. Lama perlakuan dengan larutan klorin yang diperlukan akan berbeda – beda, tergantung tipe dan sensitivitas bahan tanaman. Setelah eksplan selesai di sterilisasi, eksplan perlu dipotong supaya efektif dalam penanaman dan hasil yang diharapkan. Pemotongan dan penanaman eksplan dilakukan di LAF untuk tetap menjaga kondisi aseptiknya. Laminar air flow cabinet biasanya disteriliasi permukaan dengan 70% alkohol (v/v). Meskipun alcohol asam (70% v/v, pH 2.0) mungkin lebih efektif sebagai desinfektan, jarang digunakan karena memiliki efek korosif pada permukaan logam. Semua alat dibenamkan pada larutan 70 – 80% (v/v) ethanol dan dipanasi dengan lampu spiritus sebelum digunakan. Agar aman, sebaiknya wadah yang mengandung alcohol untuk pemanasan (flaming) diletakkan pada suatu wadah dengan dasar yang berat. Ini mencegah jatuhnya wadah alcohol akibat tersenggol secara tidak sengaja yang dapat menyebabkan kebakaran dalam laminar. Sebagai aturan umum, buanglah alkohol yang tersisa pada beaker glass setelah melalukan pengkulturan (Anonimous, 2009).

III.  METODOLOGI

3.1  Tempat dan Waktu

Praktikum Pembuatan Larutan Stock dan Penanaman Eksplan ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Pertanian (PKP) lantai 4, Universitas Hasanuddin, Makassar pada hari kamis, 31 Maret 2011  pukul 13.30 WITA sampai selesai.

3.2  Alat dan Bahan

Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum Pembuatan Larutan Stock dan Penanaman Kultur adalah buku Penuntun Praktikum Pengantar Bioteknologi Pertanian, diseccting kit, bunsel, cawan petridish dan alat tulis menulis.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah eksplan, media, wrapping plastik dan alkohol.

3.3  Prosedur Kerja

Adapun cara kerja dalam praktikum pembuatan larutan stock dan penaman eksplan ini adalah:

1. Membuat larutan stock dengan menggunakan unsur hara makro, unsur hara mikro, vitamin dan zat pembantu pertumbuhan.
2. Semprotkan kaos tangan yang kita gunakan dalam menanam kultur dengan menggunakan alkohol untuk mencegah kontaminasi pada saat penanaman eksplan.
3. Sterilkan semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam penanaman eksplan.
4. Rendam dengan alkohol dan bakar alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman kultur di atas bunsel seperti gunting, pinset dan cawan.
5. Gunting-gunting eksplan di atas cawan petridish
6. Kemudian tanam eksplan pada media yang telah disediakan sekitar 3-5 potong eksplan.
7. Kemudian tutup botol kultur yang telah berisi eksplan.
8. Tutup celah pada botol dengan menggunakan wrapping plastik.

IV.  HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Pada saat penanaman eksplan hal-hal yang harus dilakukan yaitu:

1. Mensterilkan alat dengan alkohol

2. Membakar alat di atas bunsen

3. Keluarkan eksplan dari botol kultur

4. Gunting – gunting eksplan yang akan ditanam

5. Tanam eksplan pada media yang telah disediakan

6. Tutup celah pada botol dengan wrapping plastik

7. Letakkan botol kultur yang telah ditanami eksplan pada rak kultur

4.2. Pembahasan

Dalam penanaman eksplan harus dilakukan di lingkungan yang aseptic. Hal ini sesuai dengan pendapat Anonim (2011) yang menyatakan, Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada proses penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow).

Dalam penanaman eksplan semua alat-alat yang digunakan harus steril untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang merupakan hal yang dapat menyebabkan kegagalan dalam penanaman eksplan pada media. Hal ini sesuai dengan pendapat Gunawan (1988) yang menyatakan Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba.

Selain peralatan yang digunakan yang perlu disterilisasi maka ruangan yang digunkan juga harus dalam keadaan aseptic. Hal ini sesuai pendapat Rahardja (1995) yang menyatakan, keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan.

V.  PENUTUP

5.1  Kesimpulan

Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan beberapa hal yaitu bahwa:

1. Dalam penanaman eksplan harus dilakukan dala Laminar Air Flow
2. Sebelum menggunakan alat-alat untuk penanaman eksplan alat-alat tersebut harus distrerilisasi terlebih dahulu menggunakan alkohol.
3. Kita harus menutup celah pada botol kultur untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

5.2  Saran

Sebaiknya dalam praktikum dilakukan bertahap dan semua praktikan bisa masuk agar semua praktikan mengetahui tahapan dalam penanaman eksplan ke dalam botol kultur sehingga praktikum berjalan efektif.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2009. Sterilisasi Media adan Alat. http://e-learning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi%20Alat.htm. Diakses tanggal 06 April 2011.

Anonimous. 2009. Media Kultur Jaringan. http://www.fp.unud.ac.id/biotek/kultur-jaringan-tanaman/12-media-kultur-jaringan.html. diakses tanggal 27 Desember 2009.

Gunawan, L.W. 1988. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan, PAU Bioteknologi, IPB.

Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.

Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta.